全面了解線粒體功能
1、實(shí)驗(yàn)背景
安捷倫 SeahorseXF 細(xì)胞線粒體壓力測(cè)試通過(guò)在 Seahorse XFe 和 XF 細(xì)胞外流量分析儀上直接測(cè)量細(xì)胞的氧消耗速率(OCR)來(lái)表征線粒體功能的關(guān)鍵參數(shù)。它是基于培養(yǎng)板的活細(xì)胞實(shí)驗(yàn),能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè) OCR。
實(shí)驗(yàn)使用 XF 傳感器探針板內(nèi)置的加藥孔在實(shí)驗(yàn)過(guò)中將呼吸作用的調(diào)節(jié)劑加入細(xì)胞孔中,從而得到反映線粒體功能的關(guān)鍵參數(shù)。實(shí)驗(yàn)試劑盒里的調(diào)節(jié)劑為寡霉素(Oligomycin),羰基氰-4(三氟甲氧基)苯腙(Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy)Phenylhydrazone,F(xiàn)CCP),魚(yú)藤酮(Rotenone)和kang霉素 A(Antimycin A)。
圖1 安捷倫SeahorseXF細(xì)胞線粒體壓力測(cè)試曲線,展示線粒體功能的關(guān)鍵參數(shù)
圖 2 安捷倫 SeahorseXF 細(xì)胞線粒體壓力測(cè)試 ETC 的調(diào)節(jié)劑,闡述電子傳遞鏈(ETC)復(fù)合物,并顯示 Seahorse XF細(xì)胞線粒體壓力測(cè)試試劑盒包含的所有調(diào)節(jié)劑的作用靶點(diǎn)。
寡霉素抑制 ATP 合酶(復(fù)合物 V),是實(shí)驗(yàn)中在基礎(chǔ)測(cè)量之后一次注射的化合物。它影響或減少通過(guò) ETC 的電子流,導(dǎo)致線粒體呼吸或 OCR 減少。減少的 OCR 與細(xì)胞 ATP 的產(chǎn)生相關(guān)。
羰基氰-4(三氟甲氧基)苯腙(FCCP)是一個(gè)解偶聯(lián)劑,它破壞質(zhì)子梯度和線粒體膜電位。它是寡霉素后第二次注射的化合物。加入的結(jié)果是,通過(guò)ETC的電子流不受限制,復(fù)合物IV耗氧量達(dá)到大。FCCP激發(fā)的OCR可用來(lái)計(jì)算備用呼吸能力,它的定義是大呼吸和基礎(chǔ)呼吸的差值。備用呼吸能力衡量細(xì)胞對(duì)增加的能量需求或壓力的反應(yīng)能力。
第三次注射的是復(fù)合物I的抑制劑魚(yú)藤酮和復(fù)合物III的抑制劑kang霉素A的混合物。它們聯(lián)合關(guān)閉了線粒體呼吸,從而能夠計(jì)算由線粒體外的過(guò)程驅(qū)動(dòng)的非線粒體呼吸。
表1總結(jié)了這些化合物的作用效果。
表1線粒體呼吸調(diào)節(jié)劑作用靶點(diǎn)和效果總結(jié)
化合物 | ETC靶點(diǎn) | 對(duì)OCR的影響 |
寡霉素 | ATP合酶(復(fù)合物V) | 減少 |
FCCP | 線粒體內(nèi)膜 | 增加 |
魚(yú)藤酮/kang霉素A | 分別為復(fù)合物I和III | 減少 |
對(duì)線粒體功能進(jìn)行評(píng)估使研究人員能夠進(jìn)一步了解代謝在細(xì)胞生理學(xué),疾病病理學(xué)和病因?qū)W中的關(guān)鍵作用。
SeahorseXF細(xì)胞線粒體壓力測(cè)試是測(cè)量細(xì)胞線粒體功能的金標(biāo)準(zhǔn),被廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)為了解線粒體功能障礙的原因和深入理解代謝途徑,信號(hào)和表型提供了視角。
詞匯表:
· 基礎(chǔ)呼吸(Basal respiration):用來(lái)滿足細(xì)胞ATP需求和線粒體質(zhì)子滲漏的氧消耗。表示細(xì)胞在基礎(chǔ)條件下的能量需求。
· ATP產(chǎn)生(ATP Production):加入ATP合酶抑制劑寡霉素后減少的氧氣消耗速率,代表基礎(chǔ)呼吸中被用來(lái)驅(qū)動(dòng)ATP產(chǎn)生的部分。表示用來(lái)滿足細(xì)胞能量需求的線粒體ATP產(chǎn)生。
· H+(質(zhì)子)滲漏(H+ (Proton) leak):與 ATP產(chǎn)生不偶聯(lián)的基礎(chǔ)呼吸的剩余部分。質(zhì)子滲漏可以被看作是線粒體損傷的標(biāo)志,也可被看作是一種調(diào)節(jié)線粒體ATP產(chǎn)生的機(jī)制。
· 大呼吸(Maximal respiration):加入解偶聯(lián)劑FCCP之后獲得的大氧氣消耗速率。FCCP通過(guò)刺激呼吸鏈以大能力運(yùn)轉(zhuǎn)模擬生理的“能量需求”,導(dǎo)致底物(糖,脂肪和氨基酸)的快速氧化以應(yīng)對(duì)這一代謝挑戰(zhàn)。顯示細(xì)胞能夠達(dá)到的大呼吸速率。
· 備用呼吸能力(Spare respiratory capacity):這個(gè)測(cè)量指標(biāo)表示細(xì)胞應(yīng)對(duì)能量需求的能力以及細(xì)胞呼吸與其理論大值的差距。細(xì)胞應(yīng)對(duì)能量需求的能力可作為細(xì)胞適應(yīng)性或靈活性的一個(gè)指標(biāo)。
· 非線粒體呼吸(Nonmitochondrial respiration):加入魚(yú)藤酮和kang霉素A后,由于一部分細(xì)胞中的酶繼續(xù)消耗氧而存留的氧消耗。這對(duì)于線粒體呼吸的準(zhǔn)確測(cè)量很重要。
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