永久不封国产毛片av网煮站,国产亚洲精品午夜理论片,色噜噜日韩精品一区二区三区视频,欧美成人精品久久久久久久

技術(shù)文章您的位置:網(wǎng)站首頁 >技術(shù)文章 > Western blotting檢測組織中蛋白表達實驗報告書
Western blotting檢測組織中蛋白表達實驗報告書
更新時間:2019-12-09   點擊次數(shù):4304次

一、 實驗儀器與試劑

表格一:實驗儀器

儀器

廠家

型號

小型垂直電泳槽

Biorad

164-8001

轉(zhuǎn)印槽

Biorad

Trans-Blot

脫色搖床

常州澳華

TY-80B

電泳儀

上海天能

EPS-200

低溫高速離心機

64R

BECKMAN

酶標儀  

Thermo Scientific

Multiskan Spectrum

 

表格二:試劑

試劑

廠家

RIPA 裂解液

碧云天

PMSF

Amresco

BCA 蛋白定量試劑盒

Thermo

Tris

Amresco

甘氨酸

Amresco

鹽酸

國藥集團

甲醇

國藥集團

Tween 20

國藥集團

SDS

國藥集團

TEMED

Sigma

BSA

Sigma

PVDF 膜

Millipore

HRP 標記的羊抗小鼠二抗

聯(lián)科生物

化學(xué)發(fā)光檢測試劑

Thermo

GAPDH 鼠單克隆抗體

聯(lián)科生物

預(yù)染蛋白 marker

碧云天

X 光膠片

柯達

 

二、 實驗步驟

1、組織中蛋白上清液的制備和濃度測定

把組織剪切成細小的碎片;

加入 200μL 裂解液,在勻漿機中研磨,直至裂解液中組織消失;

充分裂解后,12000rpm 離心 5min,取上清。

取部分上清蛋白用 BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度,按如下步驟:  按試劑盒說明書將 A 液和 B 液以 50:1 的比例配制成工作液;

取 2000μg/mL 的 BSA 標準品,用 PBS(pH 7.4)稀釋成 2000μg/mL、1500μg /mL、1000μg/mL、

750μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、25μg/mL、0μg/mL 共 9 個濃度梯度;

取上清液 10μL,用 PBS 稀釋 20 倍;

每管中加 20μL 蛋白標準品或稀釋后的上清液,再加上述工作液 0.2mL,37℃孵育 30min,

562nm 處測吸光度,記錄 OD 值;

根據(jù)蛋白標準品的濃度及相應(yīng) OD 值繪制標準曲線:

根據(jù)標準方程計算樣品總蛋白濃度(mg/mL)

樣品

1

2

3

4

5

6

7

8

9

OD 值

0.817611

0.438412

0.657716

0.675617

0.362568

0.817774

0.688089

0.477546

0.627511

0.991314

0.517018

0.814846

0.748083

0.460470

0.622999

0.574448

0.404516

0.700393

均值

0.904462

0.477715

0.736281

0.711850

0.411519

0.720386

0.631268

0.441031

0.663952

濃度  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

mg/mL

21.46

9.27

16.66

15.96

7.38

16.21

13.66

8.22

14.59

 

2、Western-Blot 檢測總蛋白中目的蛋白表達。

灌膠

蒸餾水清洗灌膠玻璃板,豎直晾干。

配制 13%分離膠 10mL,加 TEMED10μL、10%過硫酸銨 100μL,混勻后立即灌膠,灌至齒梳下緣 2~3mm(事先做好標記),用異丙醇封閉液面以去除氣泡并隔絕空氣,室溫靜置 45min 待膠*聚合。

待分離膠*聚合后,傾去其頂部的去離子水,用濾紙將水吸干。

配制 4%濃縮膠 5 mL,加 TEMED 5 μL、10%APS 50 μL,混勻立即灌膠,灌至頂部,并垂直插入 Teflon 齒梳,室溫靜置 20 min 待膠聚合。

待膠*聚合后拔出梳子,將凝膠置于電泳槽中,加入電泳緩沖液,用電泳緩沖液沖洗上樣孔以去除氣泡。

電泳

取各個處理組蛋白提取液,調(diào)整蛋白濃度為 6μg/μL,和等體積 2×上樣緩沖液混合,即為上樣液。

將上樣液于 100℃沸水中煮沸 5min,使蛋白變性,冰上驟冷,3000 轉(zhuǎn)/min 離心 1min。

每孔加上樣液 15μL,留一孔加 10μL 預(yù)染的 Marker。加滿電泳緩沖液,蓋上槽蓋,接通電源,先用 80v 恒壓電泳,約 20min,當指示劑溴酚藍進入分離膠后改用 110v 恒壓電泳,當指示劑到達距凝膠下端約 0.5cm 處時關(guān)閉電源,取出膠板。

轉(zhuǎn)印蛋白及免疫檢測

在電泳即將結(jié)束前,預(yù)先將 PVDF 膜浸泡在甲醇中 15s,然后用 ddH2O 漂洗 2min,浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中 5min 后開始后續(xù)操作。

在水中撬膠,修膠后將膠浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡 15min。

按黑面(負極)→海綿→濾紙→膠→PVDF 膜→濾紙→海綿→紅面(正極)的順序制備轉(zhuǎn)膜“三明治”,每層鋪好后先趕走氣泡再鋪另一層。在轉(zhuǎn)移緩沖液中制備三明治可避免氣泡的產(chǎn)生。

接上正負極,按膜向正極的方向?qū)⑥D(zhuǎn)移盒放入電轉(zhuǎn)儀中,加入轉(zhuǎn)膜緩沖液。

將電轉(zhuǎn)儀置于冰水中,100V 恒壓轉(zhuǎn)膜 1h。

轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,快速取出 PVDF 膜,放入 5%BSA 室溫封閉 2h。

取出膜,于搖床上用 TBST 洗膜 5min×3 次。

孵育袋中加入 TBST 稀釋的一抗(1:500)4℃孵育過夜。

TBST 洗膜 5min×3 次,辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗小鼠二抗(1:3000),室溫孵育 1h。

TBST 洗膜 10min×3 次。膜于化學(xué)發(fā)光檢測試劑反應(yīng)至暗處出現(xiàn)亮條帶,取出膜,甩去多余的液體,用保鮮膜包好 PVDF 膜,暗室中用 X 膠片感光、顯影、定影。

©2024  上海創(chuàng)凌生物科技有限公司 All Rights Reserved.  網(wǎng)站地圖  滬ICP備2023009255號-1  管理登陸  技術(shù)支持:化工儀器網(wǎng)
在線客服 二維碼

掃一掃,關(guān)注我們

| | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |